Nach einigen Gastauftritten in verschiedenen Sitcoms wie Good Times und Die Jeffersons bekam er 1977 seine erste wiederkehrende Rolle in der Serie Soap des Senders ABC. Diese Rolle spielte er auch im Spin-off Benson. Für seine Auftritte in den beiden Serien gewann er jeweils einen Emmy Award. Weitere seiner Serienrollen waren Edward Sawyer in The Robert Guillaume Show (1989), Bob Ballard in Pacific Station (1991) und Isaac Jaffe in Sports Night (1998–2000). Neben seinen Auftritten im Fernsehen spielte er auch verschiedene Rollen in Kinofilmen wie Meteor Man. Zudem sprach er in der englischsprachigen Version von Der König der Löwen und dessen Ablegern den Mandrill Rafiki sowie in der englischsprachigen Version des Spiels Half-Life 2 den Forscher Eli Vance.
Am 14. Januar 1999 erlitt er einen leichten Schlaganfall, von dem er sich vollständig erholte.
Guillaume starb in der Nacht auf den 24. Oktober 2017 an den Folgen von Prostatakrebs.[2]