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Florey naît à Adélaïde en Australie-Méridionale, il se fait connaître comme un étudiant brillant, et un sportif junior accompli, qui étudie la médecine à l'Université d'Adélaïde de 1917 à 1921. À l'université il rencontre Ethel Reed, elle aussi étudiante, qui devient sa femme et sa collègue. Il obtient une bourse Rhodes et continue ses études au Queen's College à Oxford
En 1938, travaillant avec Ernst Boris Chain et Norman Heatley(en), il lit un article d'Alexander Fleming sur les effets anti-bactériens de la moisissurePenicillium notatum. Il est le premier à l'utiliser en applications cliniques. Son équipe travaille par la suite sur la production à grande échelle de la moisissure et l'extraction de l'ingrédient actif de la pénicilline.
Florey est fait Chevalier en 1944[3] et reçoit la même année l'Ordre du Mérite britannique (OM). En 1945, il est colauréat avec Alexander Fleming et Ernst Boris Chain du prix Nobel de physiologie ou médecine« pour la découverte de la pénicilline et de ses effets curatifs dans plusieurs maladies infectieuses[1] ». Il est fait pair à vie en tant que Baron Florey of Adelaide and Marston en 1965. Ces honneurs sont plus élevés que ceux reçus par Fleming, reconnaissant le rôle joué par Florey dans la production de pénicilline en quantité suffisante pour sauver des millions de vies pendant la guerre, en dépit des doutes émis par Fleming sur la faisabilité de cette production de masse.
Florey est considéré par la communauté scientifique et médicale australienne comme son plus grand scientifique. Robert Menzies, le premier ministre australien ayant servi le plus longtemps, dit de lui : « en termes de bien prodigué, Florey est l'homme le plus important jamais né en Australie. »
(en) Biographie sur le site de la fondation Nobel (le bandeau sur la page comprend plusieurs liens relatifs à la remise du prix, dont un document rédigé par la personne lauréate — le Nobel Lecture — qui détaille ses apports).