Era il figlio di Cornelio, conte di Castiglione, e di Sulplizia Isolani dei conti di Minerbio.
Dopo aver ricoperto la carica di Tesoriere generale della Camera Apostolica, il 20 dicembre 1589 venne creato cardinale da papa Sisto V.
Dal 15 gennaio 1590 al 6 febbraio 1592 fu cardinale diacono dei Santi Cosma e Damiano e, in seguito, di Sant'Eustachio, fino al 12 giugno 1595.
Fu poi cardinale presbitero di San Biagio all'Anello e, succedendo al cardinale Costanzo da Sarnano, l'8 giugno 1596 divenne cardinale di San Pietro in Montorio, fino alla morte, avvenuta il 15 gennaio del 1599, quando il Pepoli aveva solo 38 anni. La sua salma venne inumata nella chiesa di San Biagio dell'Anello, in Roma.
Conclavi
Durante il suo periodo di cardinalato, Guido Pepoli partecipò ai seguenti conclavi: