Будучи вынужден жить личным трудом, Рулье поступил на службу врачом в Рижский 11-й драгунский полк, где оставался до 1836 года. Выйдя в отставку, принял предложение Г. И. Фишера фон Вальдгейма занять место репетитора при кафедре естественной истории Московской медико-хирургической академии. В 1837 году защитил диссертацию «О геморрое» и получил степень доктора медицины. После этого Рулье стал преподавать студентам минералогию и зоологию в качестве адъюнкт-профессора кафедры естественной истории. Одновременно работал в университетском Зоологическом музее: хранителем — с 1837 года, директором — с 1840 года. В 1837 году был избран членом Московского общества испытателей природы, в период 1840—1851 являлся его секретарём.
Рулье был одним из первых российских пропагандистов и популяризаторов естественных наук. Он активно читал публичные лекции, основал и редактировал научно-популярный журнал «Вестник естественных наук» (1854—1860), который издавало Московское общество испытателей природы. Рулье создал российскую научную школу зоологов-эволюционистов (Н. А. Северцов, А. П. Богданов и др.). Был основателем и директором Комитета акклиматизации животных при Обществе сельского хозяйства (с 1856). Кроме этого, в 1840 году он был избран членом Курляндского общества литературы и искусства.
Влияние внешних условий на животных и законы их географического распространения, периодические странствования птиц, ход рыбы против течения во время нереста, зооэтика — вот какие вопросы занимали Рулье. Он рассматривал организм не взятым отдельно, а в связи с миром, предшествовавшим его появлению, оценивал влияние на организм среды, в которой происходит его жизнь, ряд тех изменений и приспособлений в органах, которые вызывает эта среда, — всё это было положено в основу курса Рулье. Ещё до Ч. Дарвина он указывал, что опыт выведения новых пород животных и их акклиматизации даёт ключ к пониманию движущих сил эволюции в естественных условиях. Рулье считал, что наследственность определяется исторически сложившимися условиями, а изменчивость — условиями существования. Выступал против учения о неизменяемости вида.
Рулье активно работал в области геологии и палеонтологии Подмосковья, создав основу[источник не указан 1687 дней] для развития эволюционной палеонтологии. Его палеонтологические исследования были посвящены некоторым простейшим, аммонитам и др. Он описал ряд новых видов и ввёл сравнительно-исторический метод исследования органического мира. Работы Рулье по изучению инстинктов животных и их психической деятельности заложили основы[источник не указан 1687 дней] эволюционного направления в зоопсихологии.
Рулье К. Ф.Зообиология // Русские биологи-эволюционисты до Дарвина : материалы к истории эволюционной идеи в России / Б. Е. Райков. — М.; Л: АН СССР, 1955. — Т. 3. — С. 437—604. [Рукопись хранится в Отделе рукописей Научной библиотеки МГУ].
Рулье К. Ф. Избранные биологические произведения / Под ред., с коммент. и послесл. Л. Ш. Давиташвили, С. Р. Микулинского. — М.: АН СССР, 1954. — 688 с.
Рулье К. Ф. О влиянии наружных условий на жизнь животных // Библиотека для воспитания : журнал.
Давиташвили Л. Ш. Выдающийся русский учёный К. Ф. Рулье: (К 100-летию со дня смерти) // Известия АН СССР. Серия биологическая. — 1958. — № 3. — С. 369—373.
Иоганзен Б. Г., Коштоянц Х. С., Мельников Г. Б., Никольский Г. В. Памяти Карла Францевича Рулье : (к столетию со дня смерти) // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. — 1958. — № 2. — С. 7—9.
Микулинский С. Р. К. Ф. Рулье и его учение о развитии органического мира. — М.: АН СССР, 1957. — 356 с.
Микулинский С. Р. Карл Францевич Рулье, 1814—1858 : учёный, человек и учитель. — 2-е изд. — М.: Наука, 1989. — 285 с.
Райков Б. Е. Русские биологи-эволюционисты до Дарвина : материалы к истории эволюционной идеи в России. — М.; Л.: АН СССР, 1955. — Т. 3. — 644 с.
Императорский Московский университет: 1755—1917: энциклопедический словарь / А. Ю. Андреев, Д. А. Цыганков. — М.: Российская политическая энциклопедия (РОССПЭН), 2010. — С. 627—628. — 894 с. — 2000 экз. — ISBN 978-5-8243-1429-8.