|
Рекомбінантна ДНК Рекомбінантна ДНК — штучно створені молекули ДНК за допомогою методів генетичної рекомбінації, які поєднують генетичний матеріал різного походження. На відміну від природньої рекомбінації генетичного матеріалу, рекомбінантні ДНК створюються за допомогою низки лабораторних методів в генетичній інженерії та біотехнології. Клонування послідовностей полягає у збільшенні їхньої кількості за посередництва бактеріальних чи інших клітин, у яких може розмножуватися ДНК-вектор. У клітині-хазяїні утворюються ідентичні копії вектора зі вставленим у нього фрагментом ДНК. Під час поділу клітин рекомбінантні молекули ДНК передаються до нащадків цієї клітини. З часом утворюються колонії бактерій, які складаються з ідентичних клонів вихідної клітини, кожен з яких має одну або більшу кількість копій рекомбінантної ДНК. Цільовий фрагмент ДНК, часто це ген, у складі молекули рекомбінантної ДНК називають клонованим[1]. Унаслідок експресії рекомбінантної ДНК, можуть синтезуватися рекомбінантні білки або молекули РНК. Поєднання молекул ДНК з різних організмів можливе через їх однакову хімічну природу, хоча такі молекули різняться за нуклеотидними послідовностями, через що рекомбінантну ДНК також називають химерною[2]. ІсторіяТехнологія рекомбінантної ДНК, новаторська інновація, розроблена на початку 1970-х років, Полом Бергом з колегами, стала монументальним кроком вперед у генетичних маніпуляціях. Цей новаторський метод здійснив революцію в біології, дозволивши вченим маніпулювати молекулами ДНК поза межами природного середовища клітини, а Пол Берг згодом розділив Нобелівську премію з хімії 1980 року разом з дослідниками технології секвенування геному. За своєю суттю технологія рекомбінантної ДНК передбачає вирізання та зшивання послідовностей ДНК з різних джерел. [3][4] Цей прорив дозволив вченим вставити чужорідну ДНК в організми господаря, що призвело до створення генетично модифікованих організмів (ГМО), що було описано в науковій статті 1973 року Стенлі Н. Коеном і Гербертом Боєром та колегами зі Стенфордського університету та Каліфорнійського університету в Сан-Франциско.[5] Коен і Боєр досягли цього шляхом ідентифікації та виділення специфічних послідовностей ДНК за допомогою рестрикційних ферментів, які діють як молекулярні ножиці, здатні розщеплювати ДНК у точних місцях. Потім вони використали ДНК-лігазу, фермент, який полегшує з’єднання фрагментів ДНК, щоб з’єднати ці послідовності разом, утворюючи рекомбінантні молекули ДНК. Здатність передавати гени між різними видами відкрила сферу можливостей, уможливлюючи введення бажаних ознак в організми або модифікацію існуючих генетичних характеристик. У 1975 році на «Асиломарській конференції[en]» обговорювалося регулювання та безпечне використання технології рекомбінантних ДНК. Однак з середини 80-х років минулого століття поступово зростає кількість продуктів, створених за допомогою рДНК.[6] Інструменти та етапи створення рекомбінантної ДНКДля утворення рДНК потрібні ферменти - ендонуклеази рестрикції, лігази. Ендонуклеази - це ферменти, які розщеплюють молекулу ДНК у специфічних послідовностях або поблизу них, котрі складаються з чотирьох-восьми пар основ. Ендонуклеази у організмах бактерій є природним явищем (для захисту від проникнення чужинної ДНК, наприклад вірусу), яке використовують у лабораторній техніці [7]. Багато нуклеаз непридатні для використання у біотехнології, оскільки розщеплюють молекули ДНК випадковим чином, як результат – утворюється набір фрагментів різного розміру. Тому послуговуються ферментами, які зв’язуються з відомими сайтами на ДНК, бажано щоб вони були унікальними, що сприятиме утворенню меншої кількості фрагментів [8]. Багато рестрикційних ендонуклеаз роблять простий дволанцюговий розріз в середині послідовності розпізнавання, що призводить до утворення тупого кінця або липкого (когезивного), який містить короткі одноланцюгові виступи на кожному кінці молекули. У останньому випадку за рахунок комплементарності, кінці розрізаної молекули ДНК можуть об'єднуватись між собою. Ендонуклеази рестрикції з різними послідовностями розпізнавання можуть утворювати однакові липкі кінці. Наприклад, BamHI (послідовність розпізнавання GGATCC) і BglII (AGATCT) створюють липкі кінці GATC [1]. Результат дії рестриктаз на молекули ДНК можна перевірити, провівши електрофорез у агарозному гелі. Для визначення розміру фрагментів використовують маркер мас. Лігазами для генетичної інженерії послуговуються, щоб відновити розриви, які виникли в одному з ланцюгів дволанцюгової молекули та з'єднати разом окремі молекули ДНК або кінці однієї молекули шляхом створення двох фосфодиефірних зв'язків (по одному на кожен ланцюг) [1]. Етапи створення рДНК1. Відбір цільової послідовності, плазміди, ферментів. 2. Розщеплення відібраної молекули ДНК та плазміди ендонуклеазами рестрикції. 3. Лігування фрагменту ДНК та плазміди ДНК-лігазами, як наслідок утворюється векторна молекула. Крім послідовності інтересу вектор має містити гени, які б забезпечували відбір клітин, які містять вектор зі вставленою цільовою послідовністю. 4. Введення вектора у бактеріальну клітину, в якій відбуватиметься ампліфікація послідовності у складі вектора сумісно з поділами клітин. 5. Відбір мікроорганізмів з рекомбінантними вектором з геном інтересу [9]. Експресія ДНКУ бактеріях чи інших організмах, в яких відбувалася ампліфікація вектора з послідовністю інтересу, експерсія рДНК може відбуватися або ні. У випадку експресії можна отримувати транскрипти з цієї послідовності та рекомбінантні білки. До складу плазмід експерсії входять реплікони, промотори, селективні маркери, множинні сайти клонування, послідовності видалення злитого (рекомбінантного білка). Реплікон складається з одного сайту початку реплікації та пов’язаних з ним cis-діючих елементів. Слід підбирати копійність плазміди, оскільки збільшення кількості плазмід сприятиме зростанню концентрації білка в клітині, що може викликати метаболічне навантаження, яке зменшуватиме швидкість росту бактерій, збільшуватиме нестабільність плазмід. Найбільш поширеними промоторами є lac промотор, промотор фагу Т7. Промотори підбирають залежно від сили та його регулювання. Селективними маркерами є переважно гени антибіотиків (ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну та ін.), які використовують для відбору трансформованих клітин. Крім того, додають послідовності, які забезпечували б: 1) виявлення гена за його експресією з подальшим очищенням; 2) досягненням розчинності; 3) очищення від компонентів клітини-господаря та культурального середовища. Ці три пункти можна забезпечити шляхом наявності амінокислотної послідовності (пептидної мітки) або великого поліпептиду (партнера злиття) у тандемі з білком-інтересу, у такому випадку утворюється химерний білок [10]. Можуть додаватися послідовності, які спрямовуватимуть білок у певне місце (клітинний компартмент або позаклітинне середовище), сприятимуть (для уникнення деградації ферментними системами клітини-господаря) [11]. Відбір організмів, які містять рекомбінантну ДНКПереважно організми, які містять рДНК мають нормальний фенотип, тобто їх морфологія, метаболізм не змінилися, порівняно з організмами без такої ДНК. Щоб визначити наявність рекомбінантних послідовностей зазвичай використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Якщо ген інтересу експресується у складі вектору, то можна виявити РНК та/або білки за допомогою реакції зворотньої транскрипції (Reverse transcription polymerase chain reaction[en], RT-PCR) або шляхом вестерн-гібридизації [1]. У деяких випадках можуть спостерігатися значні зміни фенотипу, що не є нормою. Однак якщо обраний ген, продукт якого здатний генерувати біологічну активність в організмі господаря, то це можлива ситуація[12]. Прикладами є токсичність рекомбінантного білка для організму господаря, особливо якщо він надмірно експресується або експресується в невідповідних клітинах або тканинах у випадку багатоклітинних організмів-господарів. У деяких випадках рекомбінантна ДНК може мати шкідливий вплив, навіть якщо вона не експресується. Одним із механізмів, за допомогою якого це відбувається, є інсерційна інактивація, за якої рДНК вставляється в ген клітини-господаря. У деяких випадках дослідники використовують це явище, щоб "нокаутувати" гени ("knock out") та визначити їхню біологічну функцію. Інший механізм, за допомогою якого вставка рДНК у хромосому може впливати на експресію генів – активація раніше мовчазних генів клітини-господаря. Це може статися, наприклад, коли фрагмент рДНК з активним промотором розташовується поруч із раніше неактивним геном клітини-господаря, або коли хазяйський ген, функціональність якого пригнічує експресію іншого гена, піддається інсерційній інактивації рекомбінантною ДНК[13]. Застосування технології рекомбінантної ДНКрДНК широко використовується у дослідженнях, біотехнології та медицині, ветеринарії, сільському господарстві, біоінженерії, для отримання комерційних продуктів для людини та тварин, отримання самих тварин. Наприклад, GloFish є зарестрованим торговим брендом, який продає генетично модифікованих акваріумних рибок, які здатні до флуоресценції [1]. Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картування та секвенування генів, а також для визначення їхньої функції. рДНК використовують як зонди для вивчення експресії генів в окремих клітинах, тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки широко використовуються у експериментах, для створення антитіл, які слугуватимуть зондами у дослідженнях синтезу білка в клітинах і організмах [14].
Див. такожПримітки
|
