Anna war die Tochter des Königs Vladislav II. von Böhmen und Ungarn und dessen dritter Frau Anna von Foix-Candale. Schon seit ihrer Kindheit wurde um die künftige Ehe von Anna gestritten und verhandelt. Der römisch-deutsche König Maximilian I. bemühte sich, eine Erweiterung des habsburgischen Einflusses im Osten durch die Abmachung einer Doppelhochzeit zweier seiner Enkel mit Anna und deren Bruder Ludwig zu erreichen. Obwohl der ungarische Reichstag 1505 beschloss, keine Mitglieder der Habsburger als eventuelle künftige Könige von Ungarn zu akzeptieren, konnte sich Maximilian I. 1506 die Vormundschaft über Anna sichern. Ein Jahr später führte er mit Vladislav II. erste Gespräche über Annas Eheschließung mit einem seiner Enkel. Es folgten langwierige weitere Verhandlungen, die für Maximilian I. durch dessen Kanzler Matthäus Lang und den Diplomaten Johannes Cuspinian geführt wurden. In dieser Zeit soll auch Vladislavs Rivale Johann Zápolya, allerdings vergeblich, um Annas Hand angehalten haben.
Ohne die Einwilligung der ungarischen Stände kamen schließlich Vladislav II. und der mittlerweile zum Kaiser avancierte Maximilian I. 1515 überein, die Verheiratung von Anna und deren Bruder Ludwig mit den Enkeln Maximilians I. zu finalisieren (Wiener Doppelhochzeit). Die jugendliche Anna reiste in einer vergoldeten Kutsche nach Wien, wo der Kaiser sie als Stellvertreter für einen seiner Enkel am 22. Juli 1515 im Stephansdom ehelichte. Sie blieb danach in Wien. 1516 verlautbarte der in Spanien weilende Erzherzog Ferdinand, Anna an Stelle seines kaiserlichen Großvaters heiraten zu wollen und schickte eine Vollmacht nach Wien, dass die Ferntrauung mit ihm abgehalten werden könne. Daraufhin verzichtete Maximilian I. offiziell auf die Braut, und Annas Heirat per procurationem fand im Juli 1516 in der Burg zu Wien statt. Danach musste die junge Königstochter aber fünf Jahre in Innsbruck auf die Trauung mit ihrem Bräutigam in persona warten. Erst nachdem Karl V. nach seiner Wahl zum römisch-deutschen König im Wormser Vertrag vom 28. April 1521 seinem Bruder Ferdinand das Herzogtum Österreich und Innerösterreich abgetreten hatte, wurde am 26. Mai 1521 die von Kardinal Matthäus Lang zelebrierte persönliche Hochzeit von Anna und Ferdinand in Linz abgehalten.
Obwohl Annas Ehe aus rein politischen Gründen arrangiert worden war, verlief sie offenbar sehr glücklich. Der Gesandte Venedigs hob die große gegenseitige Zuneigung des Ehepaars als einzigartig hervor. Anna begleitete ihren Gemahl auf vielen seiner Reisen. Dem darüber verwunderten Gefolge gegenüber erklärte Ferdinand, es sei besser, Unkosten für die Reisen seiner Gattin aufzuwenden als für diverse Geliebte. Das Wesen Annas wird als gesellig beschrieben; auch gab sie sich sehr gern dem Tanzen hin. In Briefen an den Bischof von Trient, Bernhard von Cles, drückte sie ihre Sorge um das Leben ihres Gemahls aus, wenn er sich auf Kriegszügen befand.
Bald nach der Eheschließung ernannte Ferdinand seine Gattin zu seiner Statthalterin für die Zeit seines Aufenthalts in Brüssel. Danach vertraute er ihr die Vorsitzführung bei Landtagen an. Nach dem Tod ihres Bruders Ludwig II. 1526 in der Schlacht bei Mohács wurde Ferdinand aus ihrem Recht König von Ungarn und Böhmen. Die ungarischen Barone, die nie einen Fremdherrscher akzeptieren wollten, wählten Johann Zápolya zum Gegenkönig. Damit Anna bei Kriegsgefahr in größerer Sicherheit war, fand ein Ausbau der Linzer Burg statt.
Anna war berühmt durch ihre Religiosität, Mildtätigkeit und Klugheit; sie sprach lateinisch, tschechisch, ungarisch und deutsch. Sie wird für die Autorin der Schrift Clypeus pietatis gehalten. Für ihre 15 Kinder ließ sie 1533 gemeinsam mit ihrem Gemahl ein eigenes Erziehungsprogramm erstellen, demzufolge auch ihre Töchter eine hohe Bildung erlangen sollten. Anna verstarb am 27. Januar 1547 im Alter von 43 Jahren in Prag nach der Geburt ihrer Tochter Johanna im Kindbett. Sie wurde im Prager Veitsdom beigesetzt.
Das von Ferdinand errichtete Königliche Lustschloss in Prag wurde in späterer Zeit nach Königin Anna benannt.
Nachkommen
Aus der Verbindung zwischen Anna und Ferdinand gingen insgesamt fünfzehn Kinder hervor.
Für damalige Zeit ungewöhnlich, kümmerten sich die Eltern persönlich um ihre Kinder, die einfach und bescheiden aufwuchsen. Sie wurden nicht von Privatlehrern unterrichtet, sondern besuchten gemeinsam mit anderen Kindern eine öffentliche Schule in Innsbruck. Besonderes Augenmerk wurde auf die Erlernung von Sprachen gelegt.