Devenu chef de la majorité républicaine au Sénat en 1996, succédant à Bob Dole, il entame avec Newt Gingrich, le président de la Chambre des représentants, la réforme de l'aide médicale en 1996.
Le , lors du départ à la retraite du sénateur centenaire Strom Thurmond, il prononce un discours teinté de nostalgie ségrégationniste qui le contraint par la suite à démissionner de son poste de chef de la majorité républicaine, sous la pression de George W. Bush. C'est Bill Frist, sénateur du Tennessee, qui lui succède au poste de chef de la majorité républicaine.
Depuis, resté relativement discret, Trent Lott est sorti en 2004 de sa réserve pour critiquer l'action du secrétaire à la Défense Donald Rumsfeld et demander sa démission. Il s'est également opposé à la décision du président Bush de fermer des bases militaires situées dans son État du Mississippi.
Il est réélu en 2006 à son poste de sénateur avec 64 % des voix, contre 35 % à son adversaire démocrate, Erik Fleming.
À la suite de sa réélection, le comité républicain du Sénat élit Trent Lott comme « chief whip » (vice-président du parti minoritaire au Sénat, chargé de la discipline de vote), marquant son retour en grâce et faisant de lui le numéro deux des républicains au Congrès. Il succède ainsi à Mitch McConnell, sénateur du Kentucky, lequel était promu leader de la minorité républicaine au Sénat dans la 110e législature.
Le , Trent Lott annonce sa démission du Sénat pour la fin de l'année. S'il déclare démissionner pour passer plus de temps avec sa famille, des observateurs politiques estiment que l'entrée en vigueur d'une nouvelle loi en , augmentant de 1 à 2 ans l'interdiction pour les législateurs de participer à des entreprises de lobbying après la fin de leur mandat, n'est pas étrangère à sa démission. En démissionnant en 2007, sa future activité restera régie par l'ancienne loi.
Sa démission est effective le . Le sénateur Jon Kyl lui succède alors au poste de vice-président du parti minoritaire au Sénat.
Situation familiale
Trent Lott est père de deux enfants et grand-père de quatre petits-enfants.