Hepburn, dopo aver frequentato le università di Princeton e della Pennsylvania, divenne medico. Si trasferì come missionario in Cina ma fu costretto a permanere per un anno a Singapore a causa della chiusura della Cina agli stranieri.
Nel 1859 si trasferì in Giappone, sempre come missionario medico, dove iniziò l'opera di conversione del sistema di scrittura giapponese in caratteri dell'alfabeto romano. Il sistema di traslitterazione da lui elaborato prende il suo nome.
Hepburn è stata la prima persona a tradurre la Bibbia in giapponese oltre che autore di diversi vocabolari inglese-giapponese.
