Nestle était le fils du premier procureur de Stuttgart, Christian-Gottlieb Nestle, et de sa femme Sophie-Beate Kleinmann. Son père se remaria, lui donnant un demi-frère, le futur philologue Wilhelm Nestle(de).
Il épousa Klara Kommerell (1852-1887) à Tübingen en 1880 dont il eut un fils, Erwin Nestle. Il épousa en secondes noces Elisabeth Aichele (1867-1944) en 1890, qui lui donna cinq filles et un fils.
C’est en 1898 que l'Institut biblique du Wurtemberg fit imprimer l'édition du Nouveau Testamentgrec préparée et amendée par Nestle à partir d'anciens manuscrits et des leçons déjà connues, sous le titre « Novum Testamentum Graece cum apparatu critico ex editionibus et libris manu scriptis collecto » (en abrégé : Novum Testamentum Græce).
En quelques années, l’« édition Nestle » s'imposa à travers le monde entier comme l’édition critique de référence du Nouveau Testamentgrec. À la mort d'Eberhard Nestle, son fils Erwin reprit le travail d'élaboration du texte, y apportant de constantes améliorations et mises à jour. Kurt Aland a participé à ce travail de 1952 à sa mort, en 1994. L'« édition Nestle-Aland » du Nouveau Testament en est depuis décembre 2012 à sa 28e édition.
Œuvres
Novum testamentum Græce post Eberhard et Erwin Nestle editione vicesima septima revisa communiter ed. Barbara Aland.. . Apparatum criticum novis curis elaboraverunt Barbara et Kurt Aland una cum Instituto Studiorum Textus Novi Testamenti Monasterii Westphaliae. Stuttgart, 2005 (ISBN3-438-05115-X)