Employé dans un magasin de musique, il travaille en privé le piano avec Battesti, puis étudie l'harmonie avec Vincenzo Di Donato (1925). Il entre au conservatoire Sainte-Cécile (1928) où il étudie la composition avec Alessandro Bustini et l'orgue avec Fernando Germani. Il est diplômé du Conservatoire de Rome, au début des années 1930, en composition et orgue. Il enseigne à l'académie nationale Sainte-Cécile (1934-36), tout en étant l'élève de Bernardino Molinari.
Il est surintendant de la Fenice de Venise entre 1937 et 1940. Entre 1954 et 1956, il est le président de la Société internationale de musique contemporaine. Il donne également des cours à Tanglewood (1956), à l'Accademia Chigiana de Sienne (1966-1968).
Avec Partita per orchestra en 1932 - considérée comme repère de sa période néo-classique - Petrassi obtient la renommée internationale, en gagnant l'année suivante le premier prix au festival de musique contemporaine du Syndicat national des musiciens.
Au milieu des années 1930 démarre la phase du baroque romain, lorsque Petrassi, au moment des innovations de Stravinsky, Hindemith, Malipiero et Casella, s'intéresse à la musique du XVIe siècle et du XVIIe siècle, avec des œuvres fortement influencées par l'art baroque romain, comme Salmo IX, Magnificat et Quatre Hymnes sacrés. Dans cette perspective on peut inscrire l'utilisation du clavecin, instrument auquel Petrassi, comme plusieurs autres compositeurs contemporains, a donné une nouvelle vie après l'oubli souffert pendant le XIXe siècle.
Ensuite, à partir du Chœur de morts composé au début de la guerre sur une poésie de Giacomo Leopardi et le Dialogue de Federico Ruysch, l'attitude de Petrassi se fait plus libre et autonome, et s'approche de la mouvance expressionniste et atonale. Ce parcours culmine dans la série des huit Concertos pour orchestre composés sur une période de quarante ans, de 1934 à 1972, dans lesquels on observe le passage graduel des influences initiales de Stravinsky à l'avant-garde, toujours en restant cependant étranger au dodécaphonisme. Un grand engagement moral et spirituel nourrit beaucoup de ses compositions, de Noche oscura sur des vers de Jean de la Croix, aux Mottetti de la Passion, de Béatitudes : témoignage pour Martin Luther King à Orationes Christi, du Propos d'Alain, inspiré de la pensée du philosophe français Emile Auguste Chartier, à Elogio per un'ombra (Éloge pour ombre). Parmi les dernières œuvres, citons Poema et Tre cori sacri (Trois chœurs sacrés).
Une grande curiosité intellectuelle a poussé Petrassi à s'essayer même au théâtre musical : La follia d'Orlando (La Folie d'Orlando) et Ritratto di Don Chisciotte (Portrait de Don Quichotte), nés de la collaboration avec le chorégraphe Aurel Millos, Il Cordovano, trait de Cervantes, et Morte dell'aria (Mort de l'air) sur un livret de Toti Scialoja.
Il faut enfin mentionner ses collaborations avec le cinéma, pour lequel il a composé les bandes-son de Riso amaro (Riz amer) et de Non c'è pace fra gli ulivi (Il n'y a pas paix dans les oliviers) de Giuseppe De Santis, de Cronaca familiare (Chronique familiale) de Valerio Zurlini et de La pattuglia sperduta (La Patrouille dispersée) de Piero Nelli.