James Gunn nait et grandit à Saint-Louis, dans le Missouri[1]. Il a quatre frères, Sean, Bryan, Matt (tous trois travaillent dans le cinéma comme acteur ou scénariste) et Patrick, et une sœur, Beth. À l'âge de 12 ans, il commence à faire des films amateurs en 8 mm avec son frère Sean.
En 2000, il publie le roman The Toy Collector(en), édité chez Bloomsbury Press. L'histoire est celle d'un employé d'hôpital revendant des médicaments pour se payer des jouets de collection. Il coécrit également le livre All I Need to Know About Filmmaking I Learned from the Toxic Avenger avec Lloyd Kaufman, qui est une sorte d'autobiographie de ce dernier[1].
En 2009, il développe le projet Pets, qu'il prévoit de réaliser. Cette comédie avec Ben Stiller voit des aliens transformer des humains en animaux de compagnie[2]. En , le projet est finalement abandonné.
Il réalise l'un des sketches de la comédie My Movie Project, sorti en 2013.
Les Gardiens de la Galaxie sort durant l'été 2014, et connait un succès critique et commercial mondial : le film produit par Marvel Studios rapporte en effet plus de 775 millions de dollars[4]. Il reste ensuite dans l'univers cinématographique Marvel en réalisant Les Gardiens de la Galaxie Vol. 2 (sorti en 2017) et en tant que producteur exécutif de Avengers: Infinity War (2018) et de Avengers: Endgame (2019). Alors qu'il finalise le script du troisième film sur les Gardiens de la Galaxie, prévu pour 2020, des blagues sur la pédophilie qu'il a postées sur les réseaux sociaux en 2009 sont retrouvées et mises en avant par des figures de l'alt-right américaine[5]. Peu après, Disney annonce que Gunn est renvoyé du poste de réalisateur du film. Le réalisateur se défend en évoquant un humour noir qui ne lui correspond plus, rappelant qu'il était déjà revenu sur ses propos passés, mais accepte la décision[6]. Le studio confirme un mois plus tard que Gunn ne réalisera pas le film mais son script sera conservé[7].
Après son renvoi de Disney/Marvel, Gunn est approché par Warner Bros pour écrire Suicide Squad 2, la suite du troisième film de l'univers cinématographique DCSuicide Squad et éventuellement le réaliser[8],[9]. Cependant il est annoncé le qu'il est réembauché par Marvel pour la réalisation du 3e film des Gardiens de la Galaxie pour une sortie en 2020[10]. Devant l'absence de date de sortie pour Les Gardiens de la Galaxie Vol.3 annoncée lors du Comic-con de San Diego de 2019, Gunn répond sur Twitter qu'il réalisera d'abord The Suicide Squad avant de revenir sur le film Marvel.
Les Gardiens de la Galaxie Vol. 3 et DC Films (années 2020)
En octobre 2022, il est nommé par Warner Bros. Discovery comme co-PDG de DC Studios, avec Peter Safran[11]. En décembre 2022, James Gunn annonce travailler à l'écriture d'un film centré sur Superman. En mars 2023, il confirme qu'il réalisera le film, intitulé Superman, et dont la sortie est prévue aux États-Unis pour le mois de juillet 2025[12]. Ce film marquera les débuts de Gods and Monsters, premier chapitre du nouveau DC Universe.